業(yè)執(zhí)照.jpg)
GoldStar Best DNA Polymerase說(shuō)明書
(5×GoldStar Best PCR Buffer With Mg )2+
目錄號(hào)：K0654
保存條件：-20℃保存。
組分說(shuō)明
Cat. No. K0654 K0654A K0654C
Kit Size 250 U 500 U 6×500 U
GoldStar Best DNA Polymerase, 5 U/μl 50 μl 100 μl 6×100 μl
5×GoldStar Best PCR Buffer 1 ml 2×1 ml 3×5 ml
注意：本產(chǎn)品的5×GoldStar Best PCR Buffer中含有7.5mM鎂離子。
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
該產(chǎn)品是經(jīng)過(guò)特殊處理的熱啟動(dòng)高保真聚合酶。該聚合酶具有 5′-3′DNA聚合酶活
性，5′-3′核酸外切酶活性和3′-5′核酸外切酶活性，在普通PCR條件下，與GoldStar Taq
DNA Polymerase相比，具有擴(kuò)增效率高、錯(cuò)配率低的優(yōu)良性能?；瘜W(xué)修飾使該酶在常
溫下沒有聚合酶活性，有效避免在常溫條件下由引物和模板非特異性結(jié)合或引物二聚
體而產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增，酶的激活須在 95℃下孵育10分鐘，該條件可以整合入已有
的PCR熱循環(huán)程序。優(yōu)化的緩沖體系使酶的作用發(fā)揮大功效，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的片段的高
保真、高特異性、高擴(kuò)增效率、高靈敏度擴(kuò)增。使用本制品擴(kuò)增得到的 PCR產(chǎn)物的3′
端附有一個(gè)“A”堿基，因此可直接用于T/A克隆。本產(chǎn)品應(yīng)用于常規(guī)的PCR、RT-PCR和
多重PCR，特別適用于對(duì)特異性、保真性和擴(kuò)增效率均有較高要求的PCR。
活性定義
用活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板/引物，在74℃，30分鐘內(nèi)，將10 nmol脫
氧核苷酸摻入到酸性不溶物質(zhì)所需的酶量定義為1個(gè)活性單位（U）。
質(zhì)量控制
經(jīng)過(guò)多次柱純化， SDS-PAGE檢測(cè)其純度大于99%；經(jīng)檢測(cè)無(wú)外源核酸酶活性；
PCR方法檢測(cè)無(wú)宿主殘余DNA；能有效地?cái)U(kuò)增人基因組中的單拷貝基因；室溫存放一
個(gè)月，無(wú)明顯活性改變。
本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途
使用方法
以下舉例為常規(guī)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)模板、引物結(jié)構(gòu)和目的
片段大小不同進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)和優(yōu)化。
1. PCR反應(yīng)體系
試劑 50 μl反應(yīng)體系 終濃度
5×GoldStar Best Taq PCR Buffer 10 μl 1×
dNTP Mix，2.5 mM each 4 μl 200 μM each
Forward Primer，10 μM 2 μl 0.4 μM
Reverse Primer，10 μM 2 μl 0.4 μM
Template DNA <1 μg <1 μg/reaction
GoldStar Best Taq DNA Polymerase，5 U/μl 0.5 μl
RNase-Free Water up to 50 μl
注意：1）引物濃度請(qǐng)以終濃度0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提
高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。
2）鎂離子濃度請(qǐng)以終濃度1.5-3 mM作為設(shè)定范圍的參考。本產(chǎn)品的5×GoldStar Best Taq PCR
Buffer中已含有7.5 mM鎂離子，可根據(jù)不同引物對(duì)和模板調(diào)節(jié)鎂離子濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。
2. PCR反應(yīng)條件
步驟 溫度 時(shí)間
預(yù)變性 95℃ 10 min
變性 94℃ 30 s
退火 55-65℃ 30 s 30-40個(gè)循環(huán)
延伸 72℃ 60 s
終延伸 72℃ 5 min
注意：1）一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃，無(wú)法得到理想的擴(kuò)增效率時(shí)，適當(dāng)降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。
2）延伸時(shí)間應(yīng)根據(jù)所擴(kuò)增片段大小設(shè)定，本產(chǎn)品中所包含的GoldStar Best DNA Polymerase的擴(kuò)增效率為1 kb/min。
3）可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，錯(cuò)配機(jī)率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以在保證產(chǎn)物得率的前提下應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。
4）本產(chǎn)品須在預(yù)變性95℃，10 min條件下實(shí)現(xiàn)酶的活化。
3.結(jié)果檢測(cè)：反應(yīng)結(jié)束后取5 µl反應(yīng)產(chǎn)物，加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)：
|
