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PCR-ELISA的操作原理
1,用特殊的微孔板作為測(cè)定板,用親和素包被微孔板,然后用生物素標(biāo)記探針的3端,再通過(guò)該生物素和包被在微孔板上的親和素發(fā)生連接,將探針固定在微孔板上,形成一個(gè)固相捕獲系統(tǒng).注意:探針5端和待檢靶序列5端的一段要互補(bǔ).
2,在擴(kuò)增時(shí),引物用抗原(生物素,地高新辛或熒光素酶等)標(biāo)記,這樣擴(kuò)增產(chǎn)物中就會(huì)滲入抗原.
3,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與微孔板上的探針雜交,從而捕獲被測(cè)靶序列,由于擴(kuò)增產(chǎn)物中已經(jīng)滲入抗原,在微孔中加入HRP標(biāo)記抗體后,酶標(biāo)抗體就與靶序列的抗原免疫結(jié)合,zui后加入酶底物進(jìn)行酶促顯色,通過(guò)光密度測(cè)定實(shí)現(xiàn)定量.
PCR-ELISA比PCR本身在病毒分型,基因多態(tài)性分析與克隆鑒定等方面有其*的優(yōu)勢(shì).另外,不應(yīng)用同位素標(biāo)記,因而避免了放射性帶來(lái)的危害,而且整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期僅需6h左右,較Southern blot雜交大為縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間,操作簡(jiǎn)便,可用于大量標(biāo)本的檢測(cè).盡管與熒光素染色凝膠電泳相比較,PCR-ELISA檢測(cè)結(jié)果的特異性,靈敏性和準(zhǔn)確性有顯著的提高,但是ELISA基本上是一個(gè)開(kāi)放性的反應(yīng)系統(tǒng),特別是在洗滌ELISA反應(yīng)板時(shí),很容易造成污染,從而引起假陽(yáng)性.因此,在PCR-ELISA整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,必須進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌操作.同是,PCR-ELISA對(duì)PCR產(chǎn)物和探針的雜交條件(PCR產(chǎn)物的稀釋度,雜交溫度和時(shí)間)要求嚴(yán)格.
免疫酶技術(shù)和其他技術(shù)進(jìn)行綜合和交叉,是這個(gè)發(fā)展過(guò)程的明顯特點(diǎn).值得注意的是,電子計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù),分子生物學(xué),物理學(xué),化學(xué),材料科學(xué)和數(shù)學(xué)等科學(xué)技術(shù)的發(fā)展都將影響免疫酶技術(shù)的發(fā)展.今后,免疫酶技術(shù)很有可能和電子計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù),生物體數(shù)量基因調(diào)控的深入提示以及物理化學(xué)特殊新型材料形成新滲透和綜合,使人類對(duì)生物科學(xué)的研究以及對(duì)病原體,細(xì)菌與病毒及相關(guān)產(chǎn)物的檢測(cè)和研究達(dá)到的深度和高度.
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